Tıbbi Parazitolojide Kullanılan Boyama Yöntemleri nelerdir?

Tıbbi Parazitolojide Kullanılan Boyama Yöntemleri nelerdir?

ebuturab
Kalıcı boyama yöntemleri ile boyanmış yayma (sürme) prepreperatlar laboratuvarlara avantaj sağlarlar. Bu sayede hem kalıcı olarak kayıt tutulabilir hemde ihtiyaç olduğunda örnekler yeniden incelenebilir.
Ayrıca farklı organizma morfolojileri ile karşılaşıldığında yada teşhis zorluğu ile karşılaşıldığında bu preperatlar referans laboratuvarlara gönderilebilirler. Yukarda sayılan nedenler yüzünden her paraziter kontrole gelen dışkı örneğinden en az bir adet sürme preperatın kalıcı boyamalar ile boyanması tavsiya edilir.
Modifiya Asit-fast Boyama :
Bu boyama metodu İsospora, Crptosporidium, Cyclospora gibi coccidian parazitlrin teşhisinde kullanışlıdır. Trikrom boyamaya göre teşhiste avantaj sağlar. Modifiye asit-fast boyamada, Ziehl-Neelsen boyamada olduğu gibi boyama maddelerini ısıtmaya da gerek yoktur.
Örnek:Taze yada formalindeki dışkı örneği çökeltme ile konsantre edildikten sonra kullanılabilir. Diğer klinik örneklerde (duedonum sıvıları, safra yada akciğer sıvıları (balgam, bronş yıkantısı , biyopsi) yine bu boyama ile boyanarak incelenebilir.
Reagentlar (Boyamada kullanılacak Solusyonlar)
Asit-Fast boyamada aşağıdaki solusyonlar hazır olmalıdır.
1.Absolute Methanol (Saf Metanol)
2.Asit Alkol 10 ml Sülfirik Asit + 90 ml Absolute ethanol. Oda ısısında depolanmalıdır.
3.Kinyoun Carbol fuchsin (Karbol Fuksin)(ticari olarak satın alınabilir)
4.Malachite green %3 (Malahit yeşili)Malahit yeşilinin 3 gramını 100 ml distile suda çözdür ve oda ısısında depo et.

Boyama İşlemi
1.Dışkı örneğinin sedimentinden 1-2 damla bir lam üzerine damlatılıp yayılır. Yayılan dışkı çok kalın olmamalıdır. Bu preperat 60°C’de tamamen kurutulur.
2.Preperat absolut metanol içerisinde 30 saniye tespit edilir.
3.Karbol fuksin ile bir dakika boyanır. Distile su ile hafifce yıkanır ve suyu süzdürülür.
4.Asit alkol kullanılarak iki dakika boyama nötürleştirilir (İstenmeyen boya miktarı uzaklaştırılır.)
5.Malahit yeşili (Malachite green) ile karşı boyama yapın. Distile su ile hafifce durulayın ve suyu süzdürün.
6.Preperatı sıcak havada (60°C) beş dakika kurutun. uygun bir lamel ile preperat kapatılabilir. İstenilen bölgeler örtülerek incelemeye hazır hale getirilir.
7. Preperat mikroskop altında düşük yada yüksek büyütmeler ile incelenir. Organizmaların morfolojik detaylarını görmek için immersiyon (mineral) yağ kullanılabilir.
Kromotrop Boyama (Chromotrope) İşlemi:
Bu boyama yöntemi trikrom (trichrome) bazı boyama maddeleri kullanılarak CDC tarafından geliştirilmiştir (Centre for Disease Control and Prevention-USA). Bu metod ile microsoridia sporlarını tespit edebilmek için kullanılmaktadır.
Örnek:
Formalin ( %10) içerisinde korunmakta olan dışkı örneğinden 10 µl alınarak sürme preparat hazırlanır. Preperat ısı ile kurutulup tespit edilir (60°C’de 5-10 dakika).

Reagents (Solusyonlar):
1.Absolute methanol
2.Chromotrope Stain )kromotrop boya)
Chromotrope 2r (Kromotrop 2r) 6.00 g
Fast green )Hızlı yeşil) 0.15 g
Phosphotungstic acid (fosfotungistik asit) 0.70 g
Glacial acetic acid (Glasiyal asetik asit) 3.00 ml
Bu maddeleri karıştırıp yarım saat (30 dakika) beklet ve 100 ml distile su ilave et. Her ay taze olarak kullanmak üzere yenisini hazırla.
3.Acid alcohol: (asit alkol)
90% ethanol 995.5 ml
Glacial acetic acid 4.5 ml
4.95% ethanol
5.100% ethanol
6.Xylene (Ksilen)

Boyama İşlemi:
1.Örneği (sürme preperat) absolute methanol içinde 5 dakika tespit et.
2.Kromotrop boya içerisine koyup 90 dakika boyama yap
3.Boyamayı nötürleştir , asit alkol içerisinde 1-3 saniye.
4.Örneği % 95’lik ethanol içerisine batırarak asit alkolü durula.
5.İki % 100’lük ethanol kabı hazırla ve örneği içerisine koyarak (sıra ile) üçer dakika beklet.
6.İki ayrı ksilen (xylene yada hemo-de) kabı hazırla ve ayrı ayrı 10 dakika burada beklet.
7.preperatı süzdür ve kurutup üzerini uygun lamel ile kapatıp tespit et. İmmersiyon oil yöntemi ile en az 200 mikroskop sahasını incele.

Modifiye Safranin Tekniği (Sıcak Metod)
Cyclospora, Cryptosporidia ve Isospora için kullanılır:Klinik örneklerinde çoğunlukla Cyclospora oocystleri tespitinde Kinyoun’un modifiye acid-fast boyaması (soğuk boyama) kullanılır. Ancak, asit-fast boyama tekniğinde oocystsler farklı derecelerde boyanırlar. Boyanmış, yarım boyanmış yada boyanmamış oocystsler aynı örnekte görülebilir. Bu durum yanlış teşhislere yol açabilmektedir. Modifiye safranin tekniğinde daha üniform (aynı tipte) oocystsler elde edilir. Boyaalr ısıtıcılar yardımı ile kaynama noktalarına kadar ısıtılırlar.
Örnekler:
Concentrated sediment of fresh or formalin-preserved stool may be used. Other types of clinical specimens such as duodenal fluid may also be stained.
Solusyonlar:
1.Asit Alkol (% 3 HCl/Methanol)Hidroklorik asidi (3 ml) yavaşca absolute metanol (97 ml) içerisine ilave edip ağzı sıkıca kapalı kaplarda oda ısısında sakla.
2.Safranin Boyası
3.Malachite Green (% 3)Malachite green (malahit yeşili- 3 g)distile su içerisinde (100 ml) çözdür ve oda ısısında koru.

Boyama İşlemi:
1.İnce yayma (sürme) preperatı hazırla ve kurut.
2.Alkol içerisinde 5 dakika tespit et.
3.Distile su ile dikkatlice durula.
4.Kaynamakta olan safranin içerisinde 1 dakika boya.
5.Distile su ile dikkatlice durula.
6.Malachite green ile1 dakika karşı boyama yap.
7.Distile su ile durula ve preparatı kurut.
8.Kurumuş preperatı uygun yolla kapat ve incele.
Trichrome Boyama
Dışkıda intestinal protozoaların incelenmesinde tek ve en iyi sonuç veren yöntem dışkıdan ince yayma preperat yaparak boyama tekniğidir. Kalıcı boyama ile boyanmış preperatlarda cysts ve trophozoit taranması, tanınması (bulma ve teşhis etme) ve devamlı kayıt maddesi (kanıt) elde edilebilir. Küçük protozoalar ıslak yöntemler ile (flotasyon vb) hazırlanan incelemelerde görünmeyebilirken (hazırlama veya inceleme hatası vs) boyanmış preperatlarda tespitleri daha kolay olmaktadır.
Trichrome boyama tekniği hızlı, kolay basit bir boyama metodudur. Bu boyama ile intestinal protozoalar, insan hücreleri, mayalar yada diğer maddeler uniform olarak boyanmış halde elde edilirler.
Örnek:
Boyama için kullanılacak olan taze dışkı örneği bir lam üzerinde yayma yapılıp hemen tespit edilir. Tespit için,Schaudinn’s fiksative yada polivinil alkol (PVA) kullanılır ve havada veya ısıtılarak (60°C) kurutulur.Sodium acetate-acetic acid-formalin (SAF-sodyum asetat-asetik asit-formalin) ile tespit edilmiş örneklerde kullanılabilir.
Solusyonlar:

1.Ethanol (% 70) + iodine: Etil alkol içerisine iyot kristalleri (iodine) ekleyerek bir stok solusyonu hazırla. Solusyon tamamen koyu bir renk alana kadar iyotekle. Bu solusyonu kullanacağında kırmızımsı-kahve rengi yada demli çay rengi oluşana kadar % 70’lik etanol ilave et.
2.Ethanol % 70
3.Trichrome Boya
4.Acid-Ethanol % 90 Ethanol % 90 99.5 ml
Acetic acid (glacial) 0.5 ml
5.Ethanol % 95
6.Ethanol % 100
7.Xylene (Ksilen)

Boyama İşlemi:
1.Taze örneklerde preperatı Schaudinn’s fiksativinden çıkartıp % 70 ethanoliçerisinde 5 dakika beklet. Daha sonra % 70 Ethanol + iodine koyup bir dakika beklet. Eğer örnek PVA yayması ise preperatı % 70 ethanol + iodine içimde 10 dakika beklet.
2.Preperatı % 70 Ethanol de 5dakika beklet.
3.Preperatı ikinci % 70’lik Ethanol içinde 3 dakika beklet.
4.Trichrome boyaya koyup 10 dakika beklet.
5.Fazla boyaları % 90’lık ethanol + acetic acid ile uzaklaştır (1veya 3 saniye).
6.Örneği % 100 ethanol ile bir kaç defa durula.
7.İki kademeli % 100’lük ethanole koy (her biri 3 dakika).
8.İki kademeli xylene (ksilen) koy (her birinde 10 dakika).
9.Uygun lamel ile preperatı kapatıp yapıştır.
10.Mikroskopta 100X objektif ile (immersiyon oil) en az 200 mikroskop sahası incele.

Cevap: Tıbbi Parazitolojide Kullanılan Boyama Yöntemleri nelerdir?

ASUDE
boyama yöntemleri bir mikroorganizmanın cinsinin ve yapısının aynı zamanda sayısının belirlenmesinde kullanılmaktadır boyamada gram negatif ve gram pozitif olarak bakteriler gruplandırılır

trikrom boyama yöntemi